腺病毒包裝技術(shù)中的Z大難點(diǎn)

 　　在目前的腺病毒包裝技術(shù)中，一直困擾著技術(shù)人員的一大難點(diǎn)就是如何將外源基因表達(dá)框或者外源的shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上，如果是用現(xiàn)在比較常規(guī)的方法即酶切-連接的方式將外源基因或者shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上來(lái)進(jìn)行操作，往往成功率比較低，原因在于：我們知道，腺病毒骨架載體比較大（~30kb），而且載體中的一些常用酶切位點(diǎn)幾乎都有多個(gè)，這就造成了低成功率的現(xiàn)象。為此，我們需要采用另外一種方法對(duì)其進(jìn)行包裝即用同源重組的方法將外源基因或shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。
　　重組腺病毒的包裝制備：重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位（pfu）中分離獲得的。一個(gè)單色斑是線性載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后在20×15 cm板上由293A細(xì)胞連續(xù)侵染后被挑選和擴(kuò)增形成的。重組腺病毒可通過(guò)超速離心純化，并測(cè)定滴度及進(jìn)行PCR鑒定。純化后重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml，獲得的量為2-4 ml。
　　作為現(xiàn)在比較可靠的重組病毒表達(dá)系統(tǒng)，腺病毒可用于哺乳細(xì)胞中瞬時(shí)及高水平地表達(dá)shRNA或目的蛋白，并具有以下優(yōu)勢(shì)：
　　1、腺病毒可感染一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞，除可感染幾乎所有人的細(xì)胞類型外，還可感染包括大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種。
　　2、因腺病毒的感染不依賴細(xì)胞周期，故其既可以感染增殖細(xì)胞也可以感染非增殖細(xì)胞，且病毒滴度高，可用于動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)。
　　3、腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞特性，因大多數(shù)腫瘤細(xì)胞均屬于上皮細(xì)胞，這使得腺病毒非常適合應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域。
　　4、有較好的生物安全性。腺病毒攜帶的基因不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中；實(shí)驗(yàn)中雖然會(huì)有一定機(jī)率出現(xiàn)RCA（即復(fù)制型腺病毒），但由于大多數(shù)成人體內(nèi)都有針對(duì)腺病毒的抗體，所以一般危害不大。
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